皂苷是一類高度多樣的甾體和三萜苷類天然產物，具有廣泛的生物活性，在醫藥、食品和化妝品等領域應用廣泛。糖基化修飾是決定皂苷結構復雜性、化學穩定性、水溶性和生物活性等的重要因素，但目前甾體多糖苷的糖鏈生物合成還不清楚。重樓為珍稀名貴中藥，是100多種中成藥和中藥方劑的重要原料藥，藥材需求量大。甾體皂苷（又名重樓皂苷）是重樓主要活性成分，具有廣泛的藥理活性，但由于重樓資源匱乏、生長緩慢，皂苷分離制備過程繁瑣、化學合成困難等，嚴重限制了重樓皂苷的深入藥理研究與開發，而合成生物學和酶催化技術可提供新的解決方案。

　　中國科學院昆明植物研究所植物化學與西部植物資源持續利用國家重點實驗室，黎勝紅研究員帶領的植物活性天然產物發現與生物合成專題組聚焦于重樓皂苷的生物合成研究，取得了重要突破。專題組從滇重樓中鑒定了參與重樓皂苷生物合成的系列UDP-糖基轉移酶，實現了重樓稀有皂苷合成途徑的解析，并發現重樓皂苷對四種廣泛傳播的人類致病真菌具有顯著抑制作用，初步揭示了其抗真菌作用機制。黎勝紅專題組通過轉錄組測序、酶促反應、現代波譜技術等，闡明了合成重樓皂苷的6個UDP-糖基轉移酶（UGT），其中PpUGT1和2（UGT80A40和UGT80A41）能夠催化薯蕷皂苷元（1）和偏諾皂苷元（2）分別生成延齡草苷（3）和偏諾皂苷元-3-O-葡萄糖苷（4）；PpUGT3（UGT73CE1）進一步催化3和4的2′-O-鼠李糖基化反應，分別生成重樓皂苷V（5）和重樓皂苷VI（6）；PpUGT 4-6（UGT91AH 1-3）再進一步催化5和6的6′-O-葡萄糖基化反應，分別生成薯蕷皂苷元-3-O-鼠李糖基-(1→2)-[葡萄糖基-(1→6)]-葡萄糖苷（13）和trikamsesuquiside B（14）（圖1A）?；虮磉_模式和化合物定量分析表明，UGT91AH 1-3、UGT73CE1以及UGT80A40編碼基因主要在重樓根狀莖和須根中表達，化合物14、重樓皂苷I和II也主要在這些組織中積累。有趣的是，化合物13和14此前尚未在重樓屬植物中分離得到。本研究通過UGT克隆和功能鑒定，實現了重樓中微量稀有重樓皂苷成分的發現與生物合成。 

　　在此基礎上，底物選擇性研究發現，UGT80A40和UGT80A41表現出葡萄糖供體特異性和糖受體高度雜泛性；UGT73CE1表現出鼠李糖轉移酶特異性和糖受體雜泛性；UGT91AH 1-3表現出糖受體和供體高度雜泛性。利用6個UGT的底物雜泛性獲得24個萜類糖苷化合物，包括15個新化合物以及1個稀有人參皂苷。進一步通過分子對接和定點突變技術研究了PpUGT的催化機制，構建了44個突變酶，發現糖基受體周圍的芳香族氨基酸殘基通過與底物形成氫鍵或π堆積，在底物識別和穩定中發揮重要作用。其中，突變酶UGT91AH1^Y187A以化合物6為底物時，糖基化酶活性增加，轉化率為野生型酶的1.3倍；以化合物15為底物時，UGT91AH1^Y187A合成23a的轉化率為野生型酶的2.8倍，同時23b的合成明顯減少（圖1B），為UGT改造奠定了重要基礎。 

圖1A 重樓UGT催化的甾體皂苷糖基化級聯反應; 圖1B UGT91AH 1-3突變酶轉化率。 

　　活性研究發現，化合物S1、13、纖細薯蕷皂苷（gracillin）以及重樓皂苷I、II、V、VI、VII和H對3種皮膚癬菌（紅色毛癬菌、絮狀表皮癬菌、石膏小孢子菌）以及耐氟康唑白色念珠菌均表現出顯著抑制活性。其中，重樓皂苷I和II對紅色毛癬菌的抑制活性比陽性藥物鹽酸特比萘芬分別強12倍和4倍，MIC₅₀ 值分別為0.12 ± 0.02 μM和0.37 ± 0.01 μM。初步構效關系分析發現，C-2′位鼠李糖側鏈對該類化合物的抗真菌活性具有重要貢獻，此外，三糖苷化合物13的抗真菌活性明顯強于其二糖前體重樓皂苷V。初步作用機制研究表明，重樓皂苷主要作用于紅色毛癬菌的細胞膜，可能通過麥角甾醇依賴的方式影響膜的完整性和通透性，從而影響跨膜轉運來發揮抑菌作用（圖2），為重樓皂苷作為抗真菌藥物研發奠定了重要基礎。 

　　以上研究成果以Unraveling the serial glycosylation in the biosynthesis of steroidalsaponins in the medicinal plant Paris polyphylla and their antifungal action為題，發表在《藥學學報》英文刊APSB上。黎勝紅專題組的陳月桂博士研究生和嚴沁碩士研究生為本論文的共同第一作者，黎勝紅研究員和成都中醫藥大學劉燕教授為通訊作者，紀運恒研究員為論文共同作者。以上研究工作得到了國家自然科學基金、云南省重點研發計劃生物醫藥重大專項等項目資助。 

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圖2 化合物13和重樓皂苷I對紅色毛癬菌的抑菌作用